產品展示
PRODUCT DISPLAY
技術支持您現在的位置:首頁 > 技術支持 > His-tag蛋白純化磁珠 技術說明
His-tag蛋白純化磁珠 技術說明
  • 發布日期:2018-05-22      瀏覽次數:2320
    • His-tag蛋白純化篇
      1.蛋白不吸附或親和力低
      首先確認純化前的樣品中是否有目標蛋白。
      (1)有目標蛋白,但大量穿透:
      a、蛋白不含有標簽或未能正確表達
      解決措施:Western Blot鑒定目標蛋白是否有His-Tag。若沒有,需要重新構建載體,添加組氨酸標簽,并確認標簽正確表達。
      b、蛋白折疊導致組氨酸標簽未完全暴露
      解決措施:
      在不變性條件下純化蛋白,在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素,這樣蛋白結構相對松散,而蛋白不會變性。
      在變性條件下純化蛋白,加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。如果蛋白有二硫鍵,可加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇(在樣品中添加),可以改善蛋白的吸附。
      重新構建載體,將組氨酸標簽換到另外一端,或在組氨酸標簽基因與目的基因之間增加一段Linker,可以降低蛋白折疊后標簽被掩蓋的幾率。
      c、標簽太短  
      解決措施:將標簽的組氨酸數量增加至6-10個。
      d、蛋白標簽被水解
      解決措施:添加合適的蛋白酶抑制劑;盡量在低溫下處理樣品;對于分泌表達的蛋白,長時間存放將增加蛋白被降解的風險,應盡快處理樣品。
      e、蛋白溶解度偏低或聚集
      解決措施:在結合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100,或5%~50%的甘油,可以增加蛋白的溶解度,減少蛋白聚集。
      f、樣品及結合緩沖液不合適
      解決措施:確認樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外,將樣品及結合緩沖液pH調節至7.4~8.5,有利于蛋白結合。
      (2)有目標蛋白,但含量很低:
      蛋白表達量低。解決措施:對樣品進行濃縮,增加磁珠用量、延長反應時間;優化表達條件(誘導劑濃度、誘導溫度、誘導時間,培養基等);或更換其他合適的表達載體或表達系統。

      2.純化得到的蛋白量少
      (1)磁珠用量不足。本產品磁珠懸液濃度為10%,對于親和力較高的蛋白,每毫升磁珠懸液可結合的蛋白量約為3~4mg。用戶需要根據目標蛋白含量,使用足夠量的磁珠。對于親和力較低的蛋白,需要增加磁珠用量,延長反應時間,或提高樣品及結合緩沖液pH。
      (2)蛋白與磁珠親和力較低。參考問題1。
      (3)蛋白濃度低。對樣品進行濃縮,或增加磁珠用量、延長反應時間。
      (4)磁珠重復使用次數太多。將磁珠進行再生處理(參考產品說明書)。

      3.洗脫產物雜帶多什么原因?怎么處理?
      (1)雜蛋白吸附。由于組氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白質中很常見基團,而蛋白折疊可能導致幾個這樣的氨基酸殘基臨近,這樣也會使它們和磁珠的作用力增加??梢杂貌煌瑵舛鹊倪溥蜻M行梯度洗脫,在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100,或5~50%的甘油,可以避免因為疏水相互作用導致非特異吸附,或使用鈷離子螯合磁珠(BeaverbeadsTM IDA-Cobalt)。此外,要獲得純度較高的蛋白,需要對裂解、結合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進行優化。若還是不能獲得高純度的蛋白,則需要考慮使用多步純化,結合使用離子交換、凝聚過濾等純化方法。
      (2)菌體破碎條件太劇烈導致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎;降低超聲破碎的強度,縮短時間;適當稀釋樣品,添加核酸酶,降低樣品粘稠度。
      (3)蛋白被部分水解。添加合適的蛋白酶抑制劑,并盡可能在低溫下操作。

      4.目標蛋白難洗脫
      穿透組分中目標蛋白明顯減少,而洗脫組分中目標蛋白很少,取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min,離心跑電泳,如果發現較多蛋白殘留。
      (1)洗脫調節太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時,可以嘗試降低洗脫液pH至4.0,但低pH會也導致金屬離子脫落,磁珠需要再生后再使用。
      (2)蛋白吸附在磁珠上無法洗脫。對于非特異性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl濃度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100洗脫。對于聚集沉淀在磁珠上的蛋白(尤其注意含有二硫鍵的蛋白),可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進行變性洗脫。

      5.磁珠再生后,蛋白純化效果變差怎樣改善?
      (1)再生過程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果,參考海貍生物醫學《組氨酸標簽蛋白純化試劑盒》說明書中磁珠再生部分步驟4。
      (2)重新掛金屬離子后為清洗干凈,需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優先跟蛋白結合,影響蛋白與磁珠的結合。

      6.緩沖液中咪唑添加的意義
      (1)結合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附;
      (2)洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白;
      (3)洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。

      7.IDA-鎳和IDA-鈷的區別
      IDA-鎳的蛋白載量高,40mg/mLgel,純度稍低,純度有90%。
      IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mLgel,純度達到95%。
      一般客戶建議購買IDA-鎳磁珠,即可達到目的。

    聯系方式
    • 電話

      021-67610176

    • 手機

      13120725556

    在線客服
    《8x8x》在线观看
    掃一掃訪問手機站掃一掃訪問手機站
    訪問手機站